×
Log in to StudySoup
Get Full Access to USC - BIOL 303 - Study Guide - Final
Join StudySoup for FREE
Get Full Access to USC - BIOL 303 - Study Guide - Final

Already have an account? Login here
×
Reset your password

USC / Biology / BIOL 303 / What is a conjugative plasmid?

What is a conjugative plasmid?

What is a conjugative plasmid?

Description

School: University of South Carolina
Department: Biology
Course: Fundamental Genetics
Term: Fall 2016
Tags: Biology
Cost: 50
Name: Biology 303 exam 3 study guide
Description: these notes cover chapters 9-12
Uploaded: 04/02/2017
31 Pages 242 Views 6 Unlocks
Reviews


Exam 3 material:


What is a conjugative plasmid?



Chapter 9: Genetics of bacteria and their viruses

Vocabulary

Concepts

  ∙        Bacterial genetics: 

o Advantages of bacteria over plants or animals in genetic analysis­

 Haploid

 Fast replication

 Easy to grow

 Clone

o Disadvantages­

 Uni­cell

 Simplicity

  ∙        Mobile DNA in bacteria: 

o Plasmids (conjugative and non­conjugative)

 Conjugative plasmid­ A plasmid encoding proteins and other factors that  make possible its transmission between cells. The joining of bacterial cells in the transfer process is called conjugation, and the plasmids that can be  transferred in this manner are called conjugative plasmids.


What are plasmids?



o Insertions and transposon

o Integrin

  ∙        Properties of plasmids: 

o Plasmids­ non­essential DNA molecules that exist inside bacterial cells  Replicate independently of genome

 Segregate to progeny at division

 Copy number is regulated

 Rely on replication machinery of the host cell

 Initiation of replication is controlled by plasmid   genes Don't forget about the age old question of What is phylum hepatophyta?

  ∙        The F plasmid: a conjugative plasmid: 

o The F plasmid is a low­copy­number plasmid (1 or 2 copies/E coli cell). o It replicates once per cell cycle and segregates to both daughter cells in cell  division.


What is transduction?



o The F factor is approximately 100 kb in length and contains many gens.   o The F factor can be transmitted from F factor containing (F+) cells to F factor  lacking (F­) cells through a tuber­like structure (Pilus).

 Conjugation is mediated by a multi­subunit protein complex that is 

assembled within the cytoplasm and inner membrane of the F+ bacterium. 

 The major protein of the pilus called pilin as well as the protein 

components of the secretion apparatus are encoded in the F factor. 

 Once the pilus contacts an F­ cells, the pilus retracts and the cell 

membranes of the donor and recipient are brought into close proximity.  The secretion apparatus forms a conjugation junction containing a pore  through which DNA passes from F+ to F­ cells.

  ∙        Insertion sequence and transposons: 

o The smallest and simplest transposable elements in bacteria are insertion  sequences, or IS elements. Don't forget about the age old question of What is the byzantine empire known for?

o IS elements are typically 1­3kb in length.

o They usually encode only the transposase protein required for transposition and  one or more additional proteins that regulate the rate of transposition.

o They posses inverted­repeat sequences at their termini, which are used by the  transposase for recognition and mobilizing the IS element.

o Upon insertion, they create a short, direct duplication of the target sequence at  each end of the insertion element.

  ∙        Transposons have IS elements flanking one or more genes: 

o Many transposons contain an antibiotic resistance gene

o Other transposable elements in bacteria contain one or more genes unrelated to  transposition that can be mobilized along with the transposable element; this  type of element is called a transposon.

o The length of a typical transposon is several kilobases, but a few are much  longer.

o Much of the wild spread antibiotic resistance among bacteria is due to the spread  of transposons that include one or more antibiotic­resistant gene. 

  ∙        Non­conjugative plasmids can be mobilized by conjugative plasmids: o Mobilization occurs via recombination between the 2 plasmids

o The cointegrate can be resolved after transfer back to 2 separate plasmids o Non­conjugative plasmids and conjugative plasmids typically coexist in the same  cell along with host genomic DNA, and when a transposable element is  mobilized, all of the DNA molecules present are potential targets for insertion.  In this manner, transposable elements become disseminated among independently  replicating DNA molecules.  The result is that many non­conjugative and  conjugative plasmids present in a bacteria cell come to carry one or more  copies of the same transposable element. Don't forget about the age old question of What is the meaning of the x-axis?

o The recombination forms a composite plasmid called a cointegrate, which  becomes conjugative plasmid, and so it can be transferred in conjugation. o After conjugation, the non­conjugative plasmid can become free of the  cointegrate by recombination between the same sequences that create it.   ∙            Integron:

o Integron­ is a DNA element that encodes a site­specific recombinase as well as a  recognition region that allows other sequences with similar recognition regions to  be captured by site­specific recombination

o Site­specific recombinase­ binds with specific nucleotide sequence in duplex and  bring the sites together to catalyze a reciprocal exchange between the duplexes.  Ex: An example of a site specific recombinase is enzyme called  the Cre recombinase, which endoded in a gene in the E coli  

bacteripphage P1. the cre recognition sequence is called loxP;  Although the terminal 13bp base pairs a each end of the loxP  sequence form a perfect inverted repeat, the loxP sequence  

form a perfect inverted repeat, the loxP sequence has a  

directionality because the central region is asymmetrical.

  ∙        Integrons capture cassettes by site­specific recombination: 

o Cassette­ is a circular antibiotic­resistance­coding region flanked by a recognition  region for an integron. Because the site­specific recombinase encoded by integron sequence integrates cassettes it is called an integrase. Don't forget about the age old question of Who are bateson and punnett?

 the cassettes contain the protein­coding regions but lack promoter 

sequences of their own. They can be transcribed only by read­through  transcription from an adjacent promoter. The integron provides the needed promoter, called Pant, at a position upstream from the att I site, so that  when a cassette is captured, the coding sequence can be expressed. 

 Once one cassette is in place, a second can be captured using the same att I site and the att C present in the new cassette.  The mRNA produced from  Pant includes the coding sequences for both cassettes. But the downstream coding sequence are transcribed less frequently, up to ten antibiotic genes  have been found. Don't forget about the age old question of Ownership refers to what?

  ∙        Mechanisms of genetic exchange in bacteria: 

o Transformation­ a DNA molecule is taken up from the external environment and  incorporated into the genome

o Conjugation­ donor DNA is transferred from 1 cell to another cell by direct  contact

o Transduction­ DNA is transferred from a cell to the other by bacterial viruses   ∙        Transformation can be used to create genetic maps in bacteria: 

o Transformation begins with a recipient cell’s uptake of a DNA fragment from the  surrounding medium and terminates with one strand of donor DNA replacing the  homologous segment in the recipient DNA.

o Transformation is a convenient technique for gene mapping in some species.   When DNA is isolated from a donor bacterium, it is invariably broken into small fragments. In most species, transformation takes place at a 

frequency of about 1 transformed cell per 1000 cells. 

 If two genes used as genetic markers are wildly separated, then the  probability of simultaneously transformation of an a­b­ recipient into wild Don't forget about the age old question of Who is immanuel kant?

type is roughly 10­3X 10­3=10­6, which equals one a+b+ transformant per  106 recipient cells.

o Co­transformation of 2 genes at a frequency substantially greater than the product  of the single gene transformations implies that the 2 genes are close together in  the bacterial chromosome 

  ∙        Conjugation: F plasmid can integrate into the E. coli chromosome: o F factor can be integrated into the bacteria chromosome to create a high frequency recombination (Hfr) strain

o Episome­ a genetic element that can exist free in the cell or as a segment of DNA  integrated into the chromosome

  ∙        An Hfr cell can transfer part of the chromosome to an F­ cell through conjugation: o Differences between Hfr transfer and F transfer­

 1) The transferred DNA does not become circular and is not capable of  further replication in the recipient.

 2) time 100 mins vs 2 mins 

 3) During transfer of Hfr DNA into recipient cell, the mating pair usually  breaks apart before the entire chromosome is transferred. Complete or not  transfer 

 4) F­ not converted since the transfer starts with the region denoted as oriT in F factor, chromosome genes are transferred next, and the remaining part of F is the last DNA transferred. Because the transfer is not complete, the  final part of F is almost never transferred into the recipient. 

 5) further incorporation. In the Hfr transfer, some regions in the 

transferred DNA fragment becomes incorporated into the recipient 

chromosome.  The result is that some F­ cells become recombinants, 

containing one or more genes from the Hfr donor cell.

  ∙        Genetic maps can be made based on time of entry of genes into F­ cells: o Different Hfr strains transfer genes starting at different locations and in clockwise  or counterclockwise orientation

  ∙        A circular genetic map of E. coli: 

o Map distances are shown in minutes

o It takes 100 minutes to transfer the entire E. coli chromosome to F­ cell   ∙        An F’ is created by abnormal excision of F factor from an Hfr: 

o Chromosomal genes are transferred to the F’

o In some cases, the excision is not a precise reversal of integration. Instead   breakage and reunion take place between non­homologous sequences at the  boundary of F and nearby chromosomal DNA. Aberrant excision creates a  plasmid containing a fragment of chromosomal DNA, which is called an F’  plasmids. 

o Using different Hfr strains, different F’plasmids can be isolated, which can be  transferred to recipient cells and render recipient cells diploid for the region of the chromosome carried by the plasmid.

o Cells containing an F’ plasmid are partial diploid, called merodiploids.   ∙        Transduction: 

o Generalized transduction­ is a process in which a bacteriophage particle can carry  a small piece of any part of the host bacterial genome

o Specialized transduction­ is a process in which a bacteriophage particle can carry  only specific region of bacterial chromosomal DNA

  ∙        Generalized transduction of bacterial genes mediated by bacteriophage P1: o An example of a generalized transducing phage is the Ecoli phage P1.  o Although the majority of progeny particles contain only phage DNA, however, as 

part of the process of infection, the phage makes a nuclease that cleaves the  bacterial DNA into fragments. Occasionally, single fragments of bacterial DNA  comparable in size of P1 DNA are packaged into phage in place of P1 DNA.

o The positions of the nuclease cuts in the host are random, so a transducing particle may contain a fragment derived from any region of the host DNA.

  ∙        Transduction can be used for higher resolution gene mapping: 

o A fragment of bacterial DNA contained in a transducing particle is large enough  to include 50 genes, so transduction provides a valuable tool for genetic linkage  studies of short region of the bacterial genome.

o The probability of simultaneous transduction of both markers (co­transduction)  depends on how close to each other the genes are. The closer they are, the greater  the frequency of co­transduction.

  ∙        Specialized transduction: 

o Temperate phage­ a phage capable of both lysogenic and lytic cycle o Lysogenic cycle­ the DNA of an infecting phage becomes part of the genetic  material of the cell. The integrated phage DNA is celled the prophage and the  bacterial cell carrying the prophage is called a lysogen 

o Lytic cycle­ an infected cell breaks open and release phage particles   ∙        Insertion of A DNA into the bacterial chromosome: 

o In the mature phage, the genome is linear. After its injection, the circular DNA is  formed.  

 The reason is the end of phage DNA are single stranded, with 12 unpaired  bases, which are complementary in sequence. Upon entering the cell, the  complementary ends anneal to form a nicked circle and ligation seals the  nicks.

 Circulation is necessary for both lytic and lysogenic cycles also for DNA  replication in the lytic mode and integration in lysogeny.

o In about 75% of infected cells, the circular molecules replicates, and the lytic  cycle ensues

o In about 25% of infected cells, the circular phage molecule and the circular E.coli molecule undergo site­specific recombination catalyzed by the lamda integrase. o Because lamda can exist either as an automonous genetic element or as integrated  element, like F factor, can be classified as an episome.

o A DNA circularizes upon infection

  ∙        A DNA integration into the bacterial chromosome: 

o The T­rich strand in each att site is nicked by integrase, then the nicked strands  are transferred from attP to attB and attB to attP, and the nicks are sealed to form  a holiday junction.

o Branch migration occurs rightward through the core, the opposite strands in attP  and attB are nicked, the nicked strands are exchanged, the nicks resealed. o The products are POB’ and BoP’ with the entire genome included between the  two hybrid att sites.

  ∙        Cleavage sites and reciprocal recombination: 

o The bacterial and phage attachment sites each consist of three segements. The  central segment of 15 base pairs has the same sequence in both attachment sites  and is the region in which the recombination events takes place. The phage  attachment site is denoted as POP and the bacterial site as BOB’.

o POP’ is larger, both P and P’ extend 105 base pairs; B and B’ extend only 4 base  pairs.

o The T­rich strand in each att site is nicked by integrase, then the nicked strands  are transferred from attP to attB and attB to attP, and the nicks are sealed to form  a holiday junction.

  ∙        Site­specific recombination to create a A lysogen: 

o Since the POP site is located in the middle of phage genome, the geometry of  phage is chanegd after integration.

o The integration causes a circular permulation of its genes arising from the central  location of att in the phage map. The gene order of AJNR on the linear phage  DNA is changed to NRAJ in the integrated phage DNA. Correspondingly , the  genes on the bacterial genome at the integration sites are sperated by the inegrated phage genome.

  ∙        Abnormal excision of the A produces specialized transducing phages: o Phage genes are lost during the pick up of the host genes

∙ Summary: 

o Bacterial cells often contain three types of mobile DNA, Plasmids (conjugative or non­conjugative), Insertion sequences and transposon, and Integron. 

o DNA can be transferred between bacteria in three ways: transformation,  conjugation and transduction.

o In transformation, free DNA molecules are taken up and integrated into the  recipient chromosome through integration.

o In conjugation, donor and recipient cells pair, and a single stand of DNA is  transferred by rolling­circle replication.

o In generalized transduction, a random fragment of donor cells is packaged into a  phage particle and can be injected into recipient cells.

o In specialized transduction, only the genes on either side of the phage attachment  sites can be transferred into recipient cells

Chapter 10: molecular biology of gene expression

Vocabulary 

Concepts

  ∙        Steps in gene expression: 

o DNA (transcription)  RNA (translation)  Protein 

o Gene expression­ refers to the molecular process by which the information  contained in genes is converted into polypeptide chains that determine the  metabolic and developmental capabilities of cells and organisms

  ∙        Amino acids, polypeptides, and proteins: 

o 3 major types of proteins:

 Enzyme proteins

 Regulatory proteins

 Structural proteins

o A protein is composed of 1 or more polypeptide chains 

 Each peptide chain is a series of covalently joined amino acids

o 20 different amino acids commonly found in polypeptides

  ∙        Structure of an amino acid: 

o Each amino acid contains a carbon atom (the a carbon) to which is attached 1  carboxyl group and 1 amino group, and a side chain, and a side chain commonly  called R group

 The R groups are generally chains or rings of carbon atoms bearing 

various distinguishing atoms.

 The simplest R groups are those of glycine (­H) and of alanine (­CH3)  methyl group

  ∙        Peptide bonds join amino acids to create polypeptides: 

o R groups jut off the carbon backbone

o Amino acids are added to the carboxyl end of the polypeptide

o Peptide bond (amide bond)­ is a covalent chemical bond formed between 2  molecules when the carboxyl group of 1 molecule reacts with the amino group of  the other molecule, causing the release of a molecule of water, hence the process  is a dehydration synthesis reaction, and usually occurs between amino acids

o Amino terminus­ one end of a polypeptide molecule has a free amino (NH3)  group

o Carboxyl terminus­ the other end of a polypeptide molecule has a free carboxyl  group

o Polypeptides are synthesized by adding successive amino acids to the carboxyl  end of the growing chain and the chain is numbered starting at the amino terminus  Ex: sickle­cell anemia brings about a change in the charge of the 

hemoglobin molecule, glutamic acid (E) valine (V) 

  ∙        DNA and protein are collinear: 

o DNA sequence determines amino acid sequence in a point to point manner o Most genes contain the info for the synthesis of only 1 polypeptide chain o The order of mutations in the genetic map was the same as the order of the mutant amino acids in the polypeptide chain

 Collinearity­ means that the sequence of base pairs in DNA determines the sequence of amino acids in the polypeptide in a collinear, or point to point  manner

∙ Transcription:

o Transcription­ the process by which the info contained in DNA is copied into a  single­strand RNA molecule of complementary base sequence 

  ∙        RNA polymerases: 

o RNA polymerases­ are large multiple subunit complexes whose active form is  called the RNA polymerase holoenzyme. 

 Used exclusively in producing the transcript that becomes processed into  ribosomal RNA 

o Bacteria­ 1 RNA polymerase transcribes all genes 

o Eukaryotes­ 

 RNA polymerase 1 – rRNA 

 RNA polymerase 2­ mRNA and certain small RNAs 

∙ Responsible for transcribing all protein­coding genes as well as the genes for a number of small RNAs used in RNA processing 

 RNA polymerase 3­ tRNAs  , 5S rRNA       

  ∙        DNA serves as a template for RNA synthesis: 

o For the transcription, we need four ribonucleotide 5’­ triphosphates, RNA  polymerase, and also DNA as template.

o In the synthesis of RNA, a sugar­phosphate bond is formed between the 3’­ hydroxyl group of one nucleotide and the 5’­triphosphate of the next  nucleotide in line. This is the same chemical bonds as in the synthesis of DNA.  The linear order of nucleotides in an RNA molecule is determined by the linear  order of nucleotides in the DNA template according to Watson­crick pairing  except that T is replaced by U. nucleotides are added to the 3’­OH end of the  growing chain. As a result, the 5’end bears a triphosphate group and the 3’end  bears 3­OH group.

o A significant difference between DNA polymerase and RNA polymerase is that  RNA polymerase is able to initiate chain growth without a primer.

o Only one of the two strands serves as a template for RNA synthesis.   ∙        DNA opens up during transcription to create a transcription bubble: o How to determine which region and which strand should be transcribed? RNA  polymerase first need to find and bind to a specific region called promoter. Only  the template strand is transcribed. The transcription bubble is ~15 nt long with 8­9 nt paired with the 3' end of the RNA

  ∙        Promoters: 

o Promoter­ a specific region that RNA polymerase first needs to find and bind to  All promoters typically require accessory proteins to activate 

transcription by RNA polymerase. In bacteria, among the most important  accessory proteins for transcription are sigma factors.  A sigma factor is a protein that allows RNA polymerase to bind properly to a promoter 

region.

o In E.coli, although the promoters vary from one to another one, most of them  share two important consensus sequences. 

 the ­10 sequence is called the TATA box.  The positions of the promoter  determine where the RNA polymerase begins synthesis.

 The strength of the binding of RNA polymerase to different promoters  varies greatly, in general, the more closely the promoter elements 

resemble the consensus sequence, the stronger they are

  ∙        Eukaryotic RNA polymerase 2 promoters: 

o Promoter sequences in eukaryotes are generally much stronger and more complex than those in prokaryotes

o Many promoters recognized by polymerase II include a core region containing a  TATA­box motif, which is analogous to that in prokaryotes but differs in its  spacing relative to the transcriptional start site.

o Proper binding of Polymerase II to the promoter also requires a set of 26 general transcription factors, but even these proteins are not sufficient. They need to be  recruited to the promoter by still other proteins that bind with their upstream or  downstream motifs. Some of these motifs act as enhancers and other as  silencers

  ∙        Stages of transcription: 

o Chain initiation 

 RNA polymerase binds to initiate transcription

o Chain elongation 

 Only the template strand is transcribed

 The transcription bubble is 15 nt long with 8­9 nt paired with the 3’ end of the RNA

o Termination 

 RNA polymerase reaches a terminator sequence and the RNA and  polymerase are released

  ∙        Basal factors required to form the class 2 pre­initiation complex: 

o 6 factors + RNAP 2 = pre­init. Complex

o Factors­

 TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH

 Many are multi­subunit

 Factors + RNAP must also bind in a specific order

  ∙        TBP binds to and distorts DNA using a beta sheet inserted into the minor groove: o In the first step in transcription, the TATA­box binding protein (TBP) binds the  promoter DNA and bends it at almost a 90­degree angle Physically the TATA box binding protein is closely associated with the polymerase and the bend brings  the promoter DNA into compact with the TFIIB component of the polymerase.   ∙        Functions of TFIIA, TFIIB, TFIID, and TFIIF 

o TFIIA binds to TBP and could be considered a TAFII 

o TFIIB is needed for the polymerase/TFIIF complex to bind to TFIID and can be  thought of as a linker between the 2

o TFIIF binds to the RNAP and reduces non­specific binding of the RNAP to DNA   ∙        Functions of TFIIE and TFIIH (needed for promoter clearance): 

o TFIIE

 Binds after polymerase/TFIIF binds

 Stimulates and recruits TFIIH

o TFIIH

 Required for promoter clearance

 Has DNA helicase activity for melting DNA at transcription bubble  Has kinase activity for phosphorylation of the CTD of the large subunit of  RNAP

  ∙        Promoter clearance: 

o Promoter clearance is the first step in elongation 

o While the RNA polymerase holoenzyme remains in an open complex at the  promoter, it is able to catalyze the formation of phosphodiester bonds from  ribonucleoside triphosphates. But RNAP is stalled at +10~+12 position.  It  catalyzes the synthesis of short RNA molecules repeatedly (abortive synthesis).  The length of these molecules is limited ­ they are only 3 ­ 9 nt in length. The  number of these abortive products is characteristic of the promoter in question.  This is called abortive initiation and is common for both eukaryotes and  prokaryotes. Once the transcript reaches approximately 23 nucleotides, it no  longer slips and elongation can occur. 

  ∙        Chain elongation: 

o As the RNA polymerase encounters new nucleotides along the template DNA  strand, successive RNA nucleotides are added to the growing transcript.  Only one DNA strand, the template strand, is transcribed. At steady state, the transcription  bubble consists of fifteen nucleotides of unwound DNA duplex, of which eight o  nine are paired with the 3’end of the RNA transcript. Each incoming nucleotide is

added to the 3’end of the transcript.  at a site three nucleotides from the point at  which the DNA template strand unwinds from the non­template DNA. o About 8 to 9 nucleotides downstream from the active site, two segments of Pol II  invade the RNA­DNA hybrid, breaking the hydrogen bonds, and a few nucleotide farther downstream from the point, the DNA template and non­template DNA  strands are rejoined.

  ∙        Chain termination: 

o 2 kinds­

 Self­termination­ is the most common in bacteria, transcription stops when the polymerase encounters a particular sequence of nucleotides

∙ Contains a hairpin and a U­rich region

 The termination requires the presence of a termination protein

  ∙            Initiation of a 2nd 

   round of transcription need not wait for the completion of the first: 

o The promoter becomes available once RNA polymerase has polymerized from  fifty to sixty nucleotides. For a rapidly transcribed gene, such reinitiating occurs  repeatedly, and a gene can be cloaked with numerous RNA molecules in various  degrees of completion. The shortest transcripts are at the promoter end of the  repeat; the longest are near the terminus.

  ∙        Only 1 DNA strand is transcribed for any 1 gene: 

o Different genes can be transcribed on different strands though

o The RNA molecule produced from a DNA template is the primary transcript.  Each gene has only one DNA strand that serves as the template strand, but which  strand is the template strand can differ from gene to gene along a DNA molecule.

o In prokaryotes, the primary transcript serves directly as the messenger  RNA(mRNA) used in polypeptide synthesis. 

o In eukaryotes, the primary transcript is generally processed before it becomes  mRNA.

  ∙        RNA processing:  

o RNA processing­ the conversion of a primary transcript into an mRNA, or tRNA  molecules; including splicing, cleavage, modification of termini, and (in tRNA)  modification of internal bases.

 In prokaryotes, the primary transcript is the mRNA.

 In eukaryotes, the primary transcript must be processed.

∙ Structure of messenger RNA:

o It should be noted that transcription and mRNA processing are coupled in  eukaryotes

o RNA processing is aided by RNA polymerase 2 itself

o Translation of an mRNA molecule never starts exactly a the 5’end and proceeds  straight away to the other

o A typical coding sequence in an mRNA molecule is 500­3000 nucleotides in  length, which is translated in nonoverlapping sets of three nucleotides (the 

codons) Beyond the coding region in the mRNA, following the termination codon is a 3’untranslated region.

o In prokaryotes, most mRNA molecules are degraded within a few minutes after  synthesis. In eukaryotes, a typical lifetime is several hours.

  ∙        Steps of RNA processing: 

o 5’ capping­ addition of 7­methylguanosine in 5’ to 5’ linkage at the 5’ end o Splicing­ removal of intron and joining of exons

o 3’ polyadenylation­ addition of 200 nt polyA tail

o RNA processing usually consists of three types of events: modification of 5’end,  extension of the 3’end and excision of untranslated sequences embedded within  the coding sequences. 

  ∙        5’ cap structure: 

o 4 main functions:

 Regulation of nuclear export. 

 Prevention of degradation by exonucleases. 

 Promotion of translation

 Promotion of 5' proximal intron excision. 

  ∙        Eukaryotic mRNAs are processed: 

o Splicing recruits proteins to the exon junction that functions later to facilitate  export of the mRNA. All introns are removed to the release of the mRNA form  the transcription complex. The exon junctions are marked with export proteins as  well as proteins used in the first round of translation to detect premature chain termination codons.

  ∙        Mechanism of RNA splicing: 

o Introns have 5’ GU and 3’ AG splice sites and an internal branch site A   ∙        Smaller nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPS) mediate splicing: o RNA splicing takes place in nuclear particles known as spicesomes o snRNPs are composed of proteins and several specialized small nuclear RNA  (snRNA) molecules

o base pairing between snRNA and the intron is involved in the splicing reaction o splicing comes from the 5 types of short RNA molecules (U1, U2, U4, U5, and  U6) that are present in snRNPs

  ∙        model of spliceosome­mediated splicing of pre­mRNA : 

o U1 binds to the GU sequence at the 5' splice site, along with accessory; o U2 binds to the branch site, and ATP is hydrolyzed; 

o U5/U4/U6 trimer binds, and the U5 binds exons at the 5' site, with U6 binding to  U2; 

o U1 is released, U5 shifts from exon to intron and the U6 binds at the 5' splice site; o U4 is released, U6/U2 catalyzes transesterification, U5 binds exon at 3' splice site, and the 5' site is cleaved, resulting in the formation of the lariat; 

o U2/U5/U6 remain bound to the lariat, and the 3' site is cleaved and exons are  ligated using ATP hydrolysis. 

o The spliced RNA is released and the lariat debranches

  ∙        Ribozyme: 

o Ribozyme­ is an RNA molecule possessing a well­defined tertiary structure that  enables it to catalyze the chemical reaction in RNA splicing

 Many natural ribozymes catalyze either the hydrolysis of one of their own  phosphodiester bonds, or the hydrolysis of bonds in other RNAs.

  ∙        Splice site mutations may result in the retention of an intron: 

o Two possible outcomes of splicing mutations are shown. 

 the intron with the mutated splice site fails to be removed. The result is the production of a mutant protein with a normal sequence of amino acids up  to the splice site but abnormal sequence afterward.

 The second kind of outcome is that splicing does occur, but at an 

alternative splice site. The alternative site is called a cryptic splice site.   The cryptic site is usually a poor match with consensus sequence and is  ignored when normal splice site is available.

  ∙        3’ end polyadenylation: 

o Polyadenylation­ is the addition of a poly(A) tail to an RNA molecule  The poly(A) tail consists of multiple adenosine monophosphates; it is a  stretch of RNA which only has adenine bases. In eukaryotes, 

polyadenylation is part of the process that produces mature messenger  RNA (mRNA) for translation. It therefore forms part of the larger process  of gene expression. 

 The process of polyadenylation begins as the transcription of a gene finishes.

 The poly(A) tail is important for the nuclear export, translation and  stability of mRNA. The tail is shortened over time and when it is short  enough, the mRNA is enzymatically degraded.[2] However, in a few cell  types, mRNAs with short poly(A) tails are stored for later activation by re polyadenylation in the cytosol.[3] In contrast, when polyadenylation occurs  in bacteria, it promotes RNA degradation.[4] This is also sometimes the  case for eukaryotic non­coding RNAs.[5] The wide distribution of 

polyadenylation among living organisms indicates that this process 

evolved early in the history of life on Earth 

  ∙        mRNA is translated into protein: 

o the coding sequence of bases in mRNA specifies the amino acid sequence of a  polypeptide chain

o each group of 3 adjacent bases is a codon

o the mRNA is translated codon by codon by means of tRNA molecules o each tRNA has a different base sequence but about the same overall shape o each tRNA carries an amino acid to be added to the polypeptide chain o The synthesis of a polypeptide under the direction of an RNA molecule is known  as translation

  ∙        Translation has several principle components: 

o mRNA ­ provides the nucleotide coding sequence that determines the amino acid  sequence

o Ribosomes ­ responsible for protein synthesis

o tRNA ­ adaptor molecules that decode the nucleotide sequence to amino acid  sequence

o Aminoacyl tRNA synthetase ­ attaches an amino acid to a tRNA

o Initiation, elongation, and release factors ­ specialized proteins that aid in each  stage of translation

  ∙        The structure features of tRNA : 

o The 5'­terminal monophosphate group. 

o The acceptor stem is a 7­base pair (bp) stem made by the base pairing of the 5'­ terminal nucleotide with the 3'­terminal nucleotide. 

o The CCA tail is important for the recognition of tRNA by enzymes critical in  translation.

o The anticodon arm is a 5­bp stem whose loop contains the anticodon.  o The D and T arm secondary structures are important for the function of tRNA.  o In two dimensions, a tRNA molecuels is often drawn as a planar cloverleaf.

 One region is the anticodon sequence which consists of three nucleotide  that can form base pairs with a codon sequence in the mRNA.

∙ No normal tRNA has a anticodon complementary to any of the 

stop codons.

 A second critical site is at the 3’terminus of the tRNA molecule, where the amino acid attaches. A specific aminoacyl­tRNA synthesis matches the  amino acid with the anticodon. 

  ∙        Initiation of protein synthesis: 

o A Site­ The ribosomal site which binds the incoming aminoacyl­tRNA (Acceptor  site). 

o P Site­ The site which holds the peptidyl­tRNA, that is the tRNA which is  covalently linked to the growing polypeptide chain (Peptidyl site). 

o E Site­ A site which transiently binds to the outgoing, deacylated tRNA (Exit  site). 

o Initiation of translation usually involves the interaction of certain key proteins  with a special tag bound to the 5'­end of an mRNA molecule, the 5' cap. eIF4F  elongation factor first binds to the cap and then recruits eIF4A and eIF4B.

 This creates a binding site for the other components of the initiation  complex, which consist of a charged tRNA, bound with elongation factor  eIF2 and a small 40s ribosome subunit together with elongation factors  eIF3 and eIF5. these components all come together at the 5’cap and form  the 48s initiation complex.

  ∙        Elongation is a repeated cycle of 3 processes: 

o Elongation consists of three processes:

 Bringing each aminoacylated tRNA into line; 

 Forming the new peptide bond to elongate the polypeptide 

 Moving the ribosome to the next codon along the mRNA. 

o The key players in providing the energy for translation are the elongation factors  EF­2 and EF­1a, which alternatively occupy the same ribosomal binding site. In  thei acitv forms (EF­2­GTP and EF­a­GTP) the molecules are bound with  guanosine

  ∙        Translation termination occurs when a stop codon is reached: 

o When a stop codon is encountered, the tRNA holding the polypeptide remains in  the P site, and a release factor binds with the ribosome. GTP hydrolysis provides  energy to cleave the polypeptide from the tRNA to which it is attached, as well as  to eject the release factor and dissociate the 80s ribosome from the mRNA. 

o At this point, the 40S and 60S subunits are recycled to carry out translation of  another mRNA.

  ∙        Transcription and translation are coupled in bacteria: 

o In eukaryotes, transcription takes place in the nucleus and translation occurs in the cytoplasm

o In prokaryotes, because no nuclear envelope separates the DNA from ribosome,  the translational initiation complex can form even before the mRNA is released  from the DNA. This allows the simultaneous occurrence of transcription and  translation. 

o The length of the polysomes increase with distance from the transcription  initiation site.

  ∙        Prokaryotic ribosomes can initiate at internal sites in a mRNA : 

o Prokaryotic mRNAs can be polycistronic but eukaryotic mRNAs are  monocistronic

o Cistronic­ means a nucleotide sequence that encodes a single polypeptide chain o In a polycistronic mRNA each polypeptide coding region is preceded by its own  ribosome binding site and AUG initiation codon.

  ∙        Protein structures: 

o Primary structure­ is simply the sequence of amino acids making up the protein o Secondary structure­ the coiling or bending of the polypeptide into sheets is  referred to the proteins secondary structure. alpha helix or a beta pleated sheet are  the basic forms of this level. They can exist separately or jointly in a protein. o Tertiary structure­ The folding back of a molecule upon itself and held together  by disulfide bridges and hydrogen bonds. This adds to the proteins stability o Quaternary structure­ Complex structure formed by the interaction of 2 or  more polypeptide chains

o polypeptide molecules fold so that amino acids with charged, hydrophilic side chains tend to be in the surface of the protein in contact with water and those with uncharged, hydrophobic side chains tend to be internal.

o Two fundamental polypeptide structure are the alpha helix and the beta sheet.

o An alpha helix is formed by hydrogen bonding between peptide backbone. In  contrast, a beta sheet is formed by hydrogen bonding between peptide groups  in distant parts of the polypeptide chain, or even different polypeptide.   ∙        Alternative pathways in protein folding: 

o 70­75% of polypeptides fold upon release from the ribosome­ usually small  proteins

o Larger proteins composed of multiple folding domains fold more slowly o The proper folding of more complex polypeptides are aided by proteins called  chaperones

o Chaperones­ bind to hydrophobic groups and unstructured regions to shield them  from aggregation and give them more time to find proper folding pathway. ∙ mRNA is translated in the 5’ to 3’ direction 

  ∙        insertions and deletions in DNA provide evidence for a triplet codon: o The code on mRNA is read in nonoverlapping groups of three nucleotides  from a fixed point that establishes the reading frame of the mRNA. o Mutations that delete or add a nucleotide pair shift the reading frame and  are called frameshift mutations.

  ∙        Deletion and insertion mutations can suppress each other: 

o Deletion or insertion of 3 nucleotides often has no effect on phenotype  o If the triple mutants, the reading frame is restored, although all the amino acid  encoded between the mutations are incorrect

  ∙        Repeating RNAs were used to help solve the genetic code: 

o There are 3 stop codons that don’t code an amino acid

 UAA, UAG, UGA

 All amino acids except tryptophan and methionine are specified by more  than one codon.

 Synonymous codons usually differ only in the third nucleotide position.

  ∙        Wobble helps resolve redundancy in the genetic code: 

o The identity of the 3rd nucleotide in a codon isn’t always important

 proposed that the first two nucleotides in a codon form base pairs with the  tRNA anticodon according to the Watson­Crick base pairing. But the base  at the 5’end of the anticodon is less spatially constrained than the first two  and can form hydrogen bonds with more than one base at the 3’end of the  codon.  So the third nucleotide in a codon is not always important.

  ∙        Nonsense suppressor tRNAs can allow read­through of stop codons: o Nonsense mutation­ a nucleotide substitution that creates a stop codon result in  premature chain termination during translation

 The suppressor mutation proved to be mutant tRNA genes. These 

suppressor tRNA genes act by reading a stop codon as though it were a  signal for a specific amino acid. 

∙ Summary: 

o Transcription is carried out by the enzyme RNA polymerase in combination with  six general transcription factors TFIIA, B, E, D, F and H. 

o The mechanism of transcription can be described in terms of three distinct stages:  chain initiation, elongation and termination.

o  Initiation of a second round of transcription need not await completion of the  first.

o In eukaryotes, the RNA transcript is modified (5’capping and 3’end 

polyadenylation) and may undergo splicing to make the messenger RNA(mRNA). o Ribozyme RNA can undergo self­splicing.

o The messenger RNA is translated on ribosomes in groups of three nucleotide  (codons), each specifying an amino acid through base pairing with molecules of  transfer RNA.

o Translation includes initiation, elongation, and release of the polypeptide chain. o A single mRNA can be translated simultaneously by several ribosomes moving  along it in tandem.

o The code is highly redundant: many amino acid have several codons (wobble  rules).

o

Chapter 11: molecular mechanisms of gene regulation

Vocabulary 

Concepts

  ∙        Why gene expression needs to be regulated: 

o Prokaryotes­

 Adapt to the environment

o Eukaryotes­

 Coordinated differentiation in morphology and metabolism

 Different stages of life

 Response to the external environment

  ∙        Control points for gene expression: 

o Transcriptional regulation of the synthesis of RNA transcripts by controlling  initiation or termination

o RNA processing or regulation through RNA splicing or alternative patterns of  splicing

o Transitional control of polypeptide synthesis 

o Stability of mRNA because mRNAs that persist in the cell have longer lasting  effects than those that are degraded rapidly

o Post­transitional control which includes a great variety of mechanisms that affect  enzyme activity, activation, and stability

o DNA rearrangement in which gene expression changes depending on the position  of DNA sequences in the genome

  ∙        Important components of a gene: 

o In prokaryotes, the primary transcript serves directly as the messenger  RNA(mRNA).  In eukaryotes, the primary transcript is generally processed before it becomes mRNA.

  ∙        Prokaryotic ribosomes can initiate at internal sites in a mRNA : 

o Prokaryotic mRNAs can be polycistronic but eukaryotic mRNAs are  monocistronic

o Prokaryotic ribosomes­

 3 polypeptides are made b/c the ribosomes can initiate translation within a  mRNA

o Eukaryotic ribosomes­

 Only 1 polypeptide is made b/c the ribosomes can initiate translation only  at the 5’ end

  ∙        Transcription and translation are coupled in bacteria: 

o In eukaryotes, transcription takes place in the nucleus and translation occurs in the cytoplasm

o In prokaryotes, because no nuclear envelope separates the DNA from ribosome,  the translational initiation complex can form even before the mRNA is released  from the DNA. This allows the simultaneous occurrence of transcription and  translation. 

  ∙        Transcriptional regulation in prokaryote: 

o In bacteria and phages, on­off gene activity is often controlled through  transcription.

o In bacterial systems, when several enzyme act in sequence in a single metabolic  pathway, usually either all or none of these enzymes are produced.

  ∙        Positive regulation of transcription by activation: 

o Negative and positive regulation are not mutually exclusive, utilizing two  regulators to respond to different conditions in the cell. Negative regulation is more common in prokaryotes, positive regulation in eukaryotes

  ∙        Negative regulation of transcription­ repression and induction: 

o Inducible transcription­ 

 a repressor DNA­binding protein normally keeps transcription in the off  state. In the presence of a small molecule called inducer, the repressor 

binds preferentially with the inducer and loses its DNA­binding capacity ,  allowing transcription to occur.

o Repressible transcription­

 the default state is on until an active repressor is formed to turn it off.in  this case, the regulatory protein is called an apo­repressor, and it has no  DNA­binding activity on its own. The active repressor that bind to the  DNA is formed by the combination of the apo­repressor and a small 

molecule known as the co­repressor.

∙ Autoregulation:

o Autoregulation­ the protein product of a gene regulates its own transcription  Negative autoregulation­ the protein inhibits transcription, and high  concentrations of the protein result in less transcription of the mRNA 

 Positive autoregulation­ the protein stimulates transcription; as more  protein is made, transcription increases to the max level

  ∙        Lac Operon in E. coli: 

o In prokaryotes, the genes coding for the enzymes in a metabolic pathway are often clustered in the genome and controlled coordinately. This type of gene  organization is known as an operon

o In Ecoli, two proteins are necessary for the metabolism of lactose. They are the  enzyme beta­galactosidase, which cleaves lactose (a beta­glactoside) tp yield  galactose and glucose) and a transporter molecule, lactose permease, which is  required for the entry of lactose into the cell.

  ∙        Kinetics of induction of lac mRNA and proteins: 

o The on­off nature of the lactose­utilization system is shown by the following  observation:

 If a culture medium of Lac+ Ecoli is growing in a medium that does not  include lactose or any other beta­galactose, then the intracellar 

concentrations of b­galactosidase and permease are exceedingly low, 

however, if lactose is present, then the number of each of these molecules  is about a thousand­fold higher.

 If lactose is added to a lac+ culture growing in a lactose­free medium, then both b­galactose and permease are synthesized simultaneously. 

o These observations led to the conclusion:

 There is a polycistronic mRNA which codes for both b­galactosidase and  permease

 The transcription of the lactose gene is inducible and that lactose or its  derivative is the inducer. Some synthetic analog like IPTG can be used as  an inducer too.

  ∙        The lac operon and lacl: 

o lacl encodes repressor 

o lacO is the lac operator where repressor binds 

o lacP is the promoter

o lacZ, Y, and A are structural genes 

o When the repressor is bound to the operator, initiation of transcription of lac  mRNA by RNA polymerase is prevented.

o Inducers stimulate mRNA synthesis by binding to, and inactivating, the repressor. In the presence of an inducer the operator is not bound by the repressor, and the  promoter is available for the initiation of mRNA synthesis.

o Note that regulation of the operon requires that the lacO operator either overlap or be adjacent to the promoter of the structural genes because binding with the  repressor prevents transcription. 

o Proximity of lacI to lacO is not strictly necessary, because the lacI repressor is a  soluble protein and is therefore diffusible throughout the cell.

o The presence of inducer has a profound effect in the DNA­binding properties of  the repressor; the inducer­repressor complex has an affinity for operator that is  approximately 103 smaller than that of the repressor alone.

  ∙        Positive regulation of transcription by activation: 

o In positive regulation system, the default state is off, and binding with a  regulatory protein is required to turn it on. Such a regulatory protein is called a  transcriptional activator protein.

  ∙        Glucose is the preferred source of carbon and energy in E.coli: 

o Glucose is the preferred source of carbon and energy, and when both glucose and  lactose are present in the growth medium, transcription of the lac operon does not  take place, until all of the glucose has been consumed.

  ∙        Positive regulation of the lac operon by cAMP:  

o cAMP (cyclic adenosine monophosphate) is synthesized by the enzyme adenyl  cyclase, and the concentration of cAMP is regulated indirectly by glucose  metabolism. When bacteria are growing in a medium containing glucose, the  cAMP concentration is quite low. When the bacteria are starved of an energy  source, the cAMP concentration is high 

o cyclic AMP levels are regulated by glucose

  ∙        lac is regulated by both lac repressor and cAMP­CRP : 

o In the absence of the cAMP­CRP complex, RNA polymerase binds only weakly  to the promoter, but its binding is stimulated when cAMP­CRP is bound. o If the repressor is bound to the operator, then RNA polymerase cannot stably bind to the promoter.

  ∙        Trp operon in E.coli­ structure of the trp operon: 

o The tryptophan operon of E coli serves as an example of negative regulation in  which transcription is repressible. 

o The trp operon contains the structural genes for enzymes that synthesize the  amino acid tryptophan. When adequate tryptophan is present in the medium,  transcription of the operon is repressed, and when the supply of tryptophan is  insufficient, transcription takes place.

  ∙        Trp repressor requires tryptophan as a corepressor:

o The product of the trpR gene is an apo­repressor protein, which requires a  corepressor to become active. Mutation in either trpR or the operator cause  constitutive initiation of transcription of trp mRNA.

o The role of tryptophan is that of a corepressor, which binds with the trp apo repressor to form the active repressor. Binding of the repressor to the operator  shuts off synthesis.

  ∙        Regulation through transcription termination: 

o Attenuator­ a regulatory base sequence near the beginning of an mRNA molecule  at which transcription can be terminated

  ∙            Attenuation mechanism: the trp leader region contains a terminator site: o The attenuation mechanism controls whether transcription, once started, will  continue through the operon or be terminated prematurely. 

o The result of termination is an RNA molecule containing only 140 nucleotides  that stops short of the genes coding for the trp enzymes. 

o The 28­base region in which termination occurs is called the attenuator. The  nucleotide sequence of the attenuator region contains the usual feature of a  termination site, including a potential stem­loop configuration in the mRNA  followed by a sequence of eight uridylates.

  ∙        The trp leader mRNA has 2 trp codons: 

o The ribosome stalls at the trp codons when tryptophan is low in the cell o In ecoli, termination of transcription is determined by whether a small peptide  encoded in the leader sequence can be translated.  

o The coding sequence specified a leader polypeptide 14 Aas in length, and  includes two adjacent tryptophan codon at positoin 10 and 11.

o When there is sufficient charged tryptophan tRNA to allow translation for these  two codons, the nascent transcript adopts a conformation in which the attenuator  is exposed

  ∙        Attenuation depends on conformation of the trp leader mRNA : 

o When there is sufficient charged tryptophan tRNA to allow translation for these  two codons, the nascent transcript adopts a conformation in which the attenuator  is exposed and transcription is terminated.

o when there is insufficient charged tryptophan tRNA to allow translation of the  leader polypeptide, the ribosome stalls at the tryptophan codons, which create a  situation in which the attenuator is hidden, and transcription continues throughout  the entire operon. 

  ∙        Riboswitch: another regulation mechanism of transcription termination: o Riboswitch­ an RNA leader sequence can switch between an anti­terminator and a terminator configuration is known as a riboswitch

 It is common in prokaryotes that transcription termination is triggered by  direct binding of a small molecule to a 5’untranslated leader mRNA

  ∙        Riboswitch regulation of transcription involves the 5’ leader: 

o Terminator (T)

o Anti­terminator (AT)

o Anti­anti­terminator (AAT)

o S­ adenosylmethionine (SAM)

 The switch is controlled by S­adenosylmethionine (SAM), a modified  form of methionine.

 In the absence of SAM, the RNA adopts the anti­terminator configuration  and transcription continue. In the presence of SAM, the leader sequence  adopts the terminator configuration and transcription is halted. 

  ∙        Attenuation vs. riboswitch action: 

o Attenuation­ 

 Does not need metabolite 

 Based on conformational change  

 In the presence and absence of signal  (amino acid)  

 Transcription termination 

 Key sequence is within the coding region in the 5’­leader sequence  o Riboswitch­ 

 Needs metabolite  

 Based on conformational change  

 In the presence and absence of signal (amino acid or metabolite) 

 Transcription termination, translation termination and cleavage    

 Key sequence in the 5’­untranslated region 

  ∙        Transcriptional regulation in eukaryotic cells: 

o Many eukaryotic genes are housekeeping genes that encode essential metabolic  enzymes or cellular components and are expressed constitutively at low levels in  all cells.

o Typically levels of expression of eukaryotic genes may differ twofold to tenfold,  in contrast to thousand fold in prokaryotic cells. 

  ∙        Transcriptional regulation mechanisms: 

o Transcriptional activator and repressor

 Enhancer and silencer (DNA binding site)

 The mechanism for regulation of transcription by enhancers

o Chromatin­remodeling complexes

o Alternative promoters

o Epigenetic regulation

  ∙        Positive regulation of transcription by activator: 

o In positive regulation system, the default state is off, and binding with a  regulatory protein is required to turn it on. Such a regulatory protein is called a  transcriptional activator protein.

o Negative and positive regulation are not mutually exclusive, utilizing two  regulators to respond to different conditions in the cell. Negative regulation is  more common in prokaryotes, positive regulation in eukaryotes.

  ∙        Transcription enhancer and silencer:

o Enhancer­ is a DNA sequence to which transcriptional activator protein bind and  increase the rate of transcription of nearby genes

 Enhancer sequence are short (fewer than 20 base pairs)

o Silencer­ is a short DNA sequence that is bound by DNA binding proteins which,  once recruited to the site, promote the assembly of large protein complexes that  prevent transcription of the silenced gene

∙ Many enhancers activate transcription by DNA looping: 

o Transcriptional activators recruit the transcription machinery (RNA polymerase  and general transcription factors)

 2 or more transcriptional factors coordinately regulate gene expression  Multiple enhancer and activators can regulate a eukaryotic promoter   ∙        Regulation of GAL genes in yeast: 

o The transcriptional orientation of the 3 genes coding for enzymes are important in galactose utilization in Saccharomyces. 

o The Gal 1 and Gal 10 mRNA are synthesized from divergent promoters lying  between the genes, and GAL7 mRNA is synthesized form its own promoter. o The mRNA is synthesized only when galactose is present as inducer and are  regulated by two proteins: GAL4 and GAL80.

o Gal4 is required for transcription of all three GAL protein for transcription of all  three GAL genes

o In the presence of galactose, Gal3p binds with galactose and ATP, in this state  GAL3p can bind with GAL80p and hold it in the cytoplasm

o In the absence of galactose, the GAL3p protein can not  bind with GAL80,  GAL80 protein is therefor free to enter the nucleus

  ∙        Deletion scanning to identify regulatory sequences: 

o Reporter gene constructs can be used to easily quantify results

o Identifying the nucleotide sequences responsible for the enhancer or silencer is  usually difficult.

 The regulatory sequences typically are short, repeated, and often 

degenerate (they can differ somewhat in nucleotide sequence form one  copy to the next).

 Their function is independent of orientation (an enhancer or silencer  functions equivalently when inverted)

 They are located at variable distances from the gene that they control.  They don’t have regular repeating pattern like the three­nucleotide phasing of codons.

  ∙        Chromatin remodeling complexes can help activate transcription: 

 Nucleosomes may conceal protein­binding sites on DNA.

 Chromatin remodeling complexes help expose these sites.

∙ Use of alternative promoters at different stages in life:

 Some eukaryotic genes have two or more promoters. The different  promoters result in different primary transcripts that contain the same 

protein­coding regions

 Ex:

∙ Transcription in larvae uses a different promoter form that used in  transcription in adults. The adult transcript has a longer 5’leader 

sequence, most of this sequence is eliminated in RNA splicing.

 The versatility of some enhancers results from their ability to interact with  two different promoters in a competitive fashion; that is, at any one time,  the enhancer can stimulate one promoter or the other, but not both.

  ∙        Regulation by competition for an enhancer: 

o Which promoter is activated depends on which activator binds to the enhancer o When the enhancer is complexed with a transcriptional activator protein specific  for promoter P1, the transcription complex is recruited to P1 and transcription  takes place. When the enhancer is complexed with a different transcriptional  activator specific for promoter P2, the transcription complex is recruited to  promoter P2. in this way, competition for the enhancer serves as a switch  mechanism for expression of the P1 or p2 promoter. 

  ∙        Epigenetics: 

o Epigenetics­ heritable changes in gene expression that operate outside of changes  in DNA sequence

 Histone modification

 DNA methylation (CpG islands)

  ∙        Epigenetic chromatin regulation: 

o Histone modification­ the histone code

 Histone acetylation

  Histone methylation

  Histone phosphorylation

  Histone ubiquitylation

  Different types of histones

o Modification at the DNA level

 Cytosine methylation

  ∙        DNA methylation and gene expression: 

o 5­methyl cytosine

o Associated with inactive genes

 Degree of methylation inversely correlates with level of activity

 Methylation patterns are tissue specific

o Target sequence is CpG

 CpG islands

  ∙        Primary mRNA transcripts can undergo alternative splicing: 

o Alternative splicing of the primary transcript of the gene encoding the alpha chain of the insulin receptor in humans and other mammals

  ∙        Small interfering RNA (siRNA): 

o siRNA­ is the small cleavage product of double strand RNA used to target RNA  containing complementary sequences for destruction or for inhibition of their  function.

 About 21 nucleotides

 First ones shown to act in cytoplasm

 Cause target mRNA degradation

 Now also in nucleus and act to alter chromatin structure in “gene 

silencing”

 The main mechanism of action of siRNA is the miRNA cleavage function. There are no genes that encode for siRNAs. siRNAs can also silence gene  expression by triggering promoter gene methylation and chromatin  

condensation 

  ∙        MicroRNA (miRNA): 

o miRNA­ is about 21 to 23 bases in length, that binds to matching pieces of  messenger RNA to make it double­stranded and decrease the production of the  corresponding protein.

 miRNAs are encoded by specific miRNA genes as short hairpin pri miRNAs in the nucleus

 miRNA are also small noncoding RNAs, but they seem to require only a  7­ to 8­base­pair "seed" match between the 5' region of the miRNA and  the 3'UTR of the target. It would seem that the majority of miRNA targets  are translationally repressed

 The main mechanism of action of miRNA may be the inhibition of mRNA translation, although the cleavage of mRNA is also an important role. 

  ∙        Gene silencing by siRNA and miRNA: 

o Both siRNAs and miRNAs are produced by Dicer­mediated cleavage of longer  double­stranded RNA precursors.

o siRNA requires a perfect match in order to function. miRNA seem to require only a 7­ to 8­base­pair "seed" match between the 5' region of the miRNA and the  3'UTR of the target

  ∙        translational and post­translational regulation: 

o Regulation of the global or specific protein synthesis rate.

o Antisense RNA controlling translation in both prokaryotic and eukaryotic cells . o Protein modification: phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination  and many others.

  ∙        Translational control by small regulatory RNAs: 

o An RNA sequence complementary to part of an mRNA is called an antisense  RNA. The anti­sense regulatory Rna act by pairing with the mRNA to either  inhibit or activate translation.

o Such a bipartite complex composed of a small regulatory RNA and an mRNA is  called a kissing complex.

  ∙        Antibody variability is high due to DNA joining: 

o light chain

 250 V regions

 4 J regions

 250 x 4 = 1000

o heavy chain

 250 V regions

 10 D regions

 4 J regions

 250 x 10 x 4 = 10,000

o 1000 light chains

o x 

o 10000 heavy chains

o = 107 possibilities

∙ Summary: 

o Gene expression can be regulated in many ways.  In prokaryotes, transcriptional  regulation may be either negative or positive.  

o In prokaryotes, the genes coding for the enzymes in a metabolic pathway are often organized as an operon.

o Lactose operon is a classic example of an inducible repressive system and is also  subject to positive regulation.

o Trp operon is an example of an active repressor­regulated system and is also  subject to fine tuning by attenuation, in which transcripts forms a hairpin structure resulting in premature termination.

o Riboswitch is another regulation mechanism of transcription termination o In eukaryote, gene expression can be regulated in many ways including  transcriptional regulation, RNA processing , translational control, and 

posttranslational control  and DNA rearrangement.

o At transcriptional level, transcriptional activators bind to DNA sequence known  as enhancers and directly interact with one or more protein components of the  transcription complex.

o Gene expression can also be regulated at the level of RNA processing, alternative  splicing or mRNA stability mediated by siRNA.

o At the level of translation, miRNA or antisence RNA can bind to their target  mRNAs and block translation.

o Genetic regulatory mechanisms also occasionally include changes in DNA  sequence by DNA rearrangement.

Chapter 12:

Concepts:

  ∙        Key concepts: 

o Cloned DNA: a DNA sequence incorporated into a vector molecule capable of  replication in the same or a different organism.

o Genomics: deal with DNA sequences, functions, organization, and evolution of  the genome

o Proteomics (2­hybrid screen) 

o genetic engineering: DNA is isolated and cut into fragments by one or more  restriction enzymes; then the fragment are joined together in a new combination  and introduced into a cell or organism to change its genotype in a directed ,  predetermined way. Such genetically engineered organisms are called transgenic  organism. The technique is known as gene cloning or genetic engineering.   ∙        Restriction enzymes can generate sticky or blunt ends: 

o The technology of recombinant DNA relies heavily on restriction enzymes, which cleave DNA at specific site to generate DNA fragments

o When the cleavage is asymmetrical, the overhanging ends are sticky 

o When the cleavage site is symmetrical the resulting ends are blunt 

o When DNA is cleaved, a free 3’ hydroxyl group and a free 5’phosphate group are  created.  The 3’­OH and 5’­P can be covalently joined by DNA ligase

  ∙        Restriction enzymes cut DNA and ligase joins the ends: 

o Any 2 sticky ends produced by the same restriction enzyme can come together  and form base pairs

  ∙        DNA fragments can be cloned into a plasmid for replication in bacteria: o Plasmid is a DNA molecule present in a cell, usually a bacterial cell, that is  capable of replicating independently of the bacterial chromosome.

o Small circular plasmids containing single cleavage site for a particular restriction  enzyme are especially valuable as vectors in DNA cloning.

o In recombinant DNA, a particular DNA segment of interest is joined to a vector.  The recombinant molecules is introduced into a cell by means of a transformation  procedure or electroporation.

o After transformation, as the cellular DNA replicates, so does the recombinant  DNA. When stable transformant has been isolated, the DNA sequences linked to  the vector are said to be cloned.

  ∙        Cloning vectors: 

o The vector DNA can be introduced into a host cell relatively easily

o The vector and any DNA it contains can be replicated inside the host cell o Cells containing the vector can be identified in a straightforward manner (for  example, antibiotics resistance).

  ∙        DNA insertion limits for different cloning vectors: 

o Some larger fragments can be cloned with bacteriophage lamda genome. The  normal lamda genome is about 50 kb in length but because the central portion of 

the genome is not essential for infection and phage propagation, this portion can  be removed and replaced with donor DNA

o Larger DNA fragment can be inserted into cosmid vectors.  These vectors can  exist as plasmids but they can also contain the phage single­stranded sticky ends  of 12kb known as cohesive ends. Cosmids can be packaged into mature phage  particles by virtue of the cohesive ends. The size limitation   on cosmid inserts  ranges from 40­45kb. 

  ∙        A F­Factor derived vector (BAC, bacterial artificial chromosome): o A BAC vector can accept very large inserts (several hundred Kb) 

o BAC­ Large fragment can be cloned intact in bacterial cells with the use of  specialized vectors, called BAC. The vector is based on the F factor of E coli o The essential functions included in the vector are genes for replication and for  regulating copy number, and for chloramphenicol resistance

 These vectors are very useful for genome sequence. The entire genome of  drosophila could be contained in only 550 clones of this size. 

  ∙        Cloning strategies: 

o In genetic engineering, the immediate goal of an experiment is to insert a  particular fragment of chromosomal DNA into a plasmid or a viral vector o Important steps:

 1. Purification of donor DNA and vector DNA

 2. Cleavage with one or more restriction enzymes

 3. Joining donor DNA with vector DNA

 4. identification and isolation of desired recombinant clones.

  ∙        2 methods for fragment isolation: 

o Restriction digestion (complete or partial digestion) followed by gel purification. o Amplification by means of the polymerase chain reaction (PCR)  

 PCR­ is used to replicate the DNA fragment, after a sufficient number of  rounds of replication, the resulting solution contains predominantly 

replicas of the amplified fragments.  But if the fragment is too long to be  amplified by PCR, restriction digestion is the only choice. 

  ∙        DNA fragments and vector DNA must have matching sticky ends: 

o Because a particular restriction enzyme produces fragments with identical sticky  ends, without regard for the sources of the DNA, fragments from DNA molecules  can be joined. 

o When the donor fragment and linearized plasmid are mixed, recombinant  molecules can form by base pairing between the complementary single­stranded  ends. At this point, the DNA is treated with DNA ligase to seat the joints. 

o The ability of join a donor DNA fragment of interest to a vector is the basis of the  recombinant DNA technology. 

  ∙        Fragments with matching ends may join in many arrangements:

o Because any sticky end can base­pair with any other complementary sticky ends,  the joining of restriction fragments at random can produce a variety of products,  including many that are useless. 

o Ligation of restriction fragments with blunt ends produces even more  combinations, because any blunt end can be joined with any other blunt end. o Restriction fragments from the vector, if there are more than one, can also join  together in the wrong order. This problem can be eliminated by using two  different restriction enzyme to digest the vector and the fragment of interest. So  each end of the vector and fragment have different sequences

  ∙        Reverse transcriptase can create cDNA from RNA: 

o This tail loops back onto the ss cDNA template ( the so­called hairpin loop ) and  provides the primer for the polymerase to start the synthesis of the new DNA  strand producing a double stranded cDNA (ds cDNA). This is a traditional way to synthesize DNA before PCR was invented.

  ∙        Useful features of a plasmid cloning vector: 

o 1.The plasmid origin of replication ( the positon at which DNA replication  begins) is derived from the Ecoli plasmid ColE1. the ColE is a high copy number  origin, which enable the plasmids to exist in approximately 300 copies.

o 2. The amplication­resistance gene allows for selection of transformed cells in  medium containing ampicillin.

o 3. The cloning site, called a multiple cloning site (MCS) or polylinker, contains  unique cleavage sites for many different restriction sites. It allows various  fragments to be inserted.

o 4. The bacteriophage origin enable a single­strand of the inserted fragment to be  packaged in progeny phage, very useful for DNA sequencing.

  ∙        Color screening of recombinant clones using the lacZ a­peptide: 

o Two types pf the cells can be distinguished by color when the growth medium  contains a special beta­galactoside compound called X­gal, which release a deep  blue dye when cleaved. On the medium, the colonies whose cells contain non recombinant plasmids produce galactosisase and turn a deep blur color, whereas  colonies whose cells contain recombinant plasmids produce no enzyme and  remain the normal white color.

  ∙        Functional classification of genes in Mycoplasma genitalium: 

o Mycloplasma genitalium has the smallest genome of any known free living  organism

o Analysis of the M genitalium genome enables us to identify what is probably a  minimal set of genes necessary for a free­living cell

  ∙        DNA microarrays: 

o DNA microarrays­ rely on the hybridization properties of nucleic acids to monitor DNA or RNA abundance on a genomic scale in different types of cells. o Two types of DNA chips are presently in use:

 A chip arrayed with oligonucleotide synthesized directly on the chip.

 A chip arrayed with denatured, double­stranded DNA sequences of 500­ 5000 adjacent.

  ∙        Features of microarray: 

o Analyze thousands of genes simultaneously

o Don’t need so much RNA from your experimental cells

o Make quantitative measurements

  ∙        cDNA microarrays (chips): 

o Fluorescently tagged cDNA probes are hybridized to DNA spots in the  microarray for studying differential expression of thousands of genes at a time in  two mRNA samples

  ∙        2­hybrid analysis makes use of the GAL4 transactivator protein in yeast: o The Gal4 protein includes two domains or regions, both of which are necessary  for transcriptional activation. One domain id the zinc­finger DNA­binding domain that binds with the target site in the promoter of the Gal4 gene that are activated,  and the other domain is the transcriptional activation domain that makes contact  with the transcriptional complex and actually triggers transcription. In the  wildtype GAL4 protein, these domains are tethered together because that are parts of the same polypeptide chain.

  ∙        2­hybrid analysis to identify protein­protein interactions: 

o The key to identifying protein­protein interaction through the use of Gal4 is that  the coding regions for the separate domains can be taken apart and each fused to a coding region for a different protein

  ∙        Transgenic vs. knock­out: 

o Transgenic: an organism that has had DNA introduced into one or more of its  cells artificially.

 DNA is integrated in a random fashion

 multiple copies

o Knockout: Gene is disrupted by inserting a  DNA cassette into its coding  sequence.

 targeted insertion

 One or two copies

  ∙        Transgenic mice as tools: 

o Study gene function 

 Many human diseases can be modeled by introducing the same mutation  into the mouse. Intact organism provides a more complete and 

physiologically relevant picture of a transgene's function than in vitro

testing

o Drug testing

  ∙        Gene knockout and gene replacement in stem cells: 

o The procedure for introducing changes into specific genes is called gene targeting

o The specificity of gene targeting comes from DNA sequence homology between  the introduced recombinant DNA and normal sequences already present in the  chromosome.

o When the sequences are similar enough, they can undergo pairing as the result of  an exchange of complementary strands followed by a process of breakage and  reunion. The vector normally contains only the flanking sequences, not the target  gene itself, so the homologous recombination results in either an insertion of a  novel DNA sequence or replacement of the targeted gene with an unrelated  sequence. In both cases, the targeted gene are inactivated or knocked out.   ∙        Transgenic plants: 

o Improved Nutritional Quality (transgenic rice expressing beta­carotene). o Insect Resistance (transgenic plants expressing BT (Bacillus thuringiensis)  toxin).

o Disease Resistance (resistant to plant viruses).

o Herbicide Resistance (transgenic plants expressing a enzyme degrading  herbicide).

o Salt Tolerance

  ∙        Gene therapy: 

o In 1990, Dr French Anderson performed the first approved gene therapy  procedure on four­year old Ashanthi DeSilva. Born with a rare genetic disease  called severe combined immunodeficiency (SCID

o Jesse Gelsinger (1981 ­ 1999) was the first person publicly identified as having  died in a clinical trial for gene therapy. He was 18 years old. Gelsinger suffered  from ornithine transcarbamylase deficiency, an X­linked genetic disease of the  liver, whose victims are unable to metabolize ammonia.

  ∙        Summary: 

o Important steps in genetic engineering include: 1) Purification of donor DNA and  vector DNA; 2) Cleavage with one or more restriction enzymes; 3)Joining donor  DNA with vector DNA; and 4) Identification and isolation of desired recombinant clones.

o Functional genomics using DNA microarrays enables global patterns and  coordinated regulation of gene expression to be investigated.

o Proteomic methods such as two­hybrid analysis enable to identity and study the  function of proteins in a global fashion.

o Transgenic or knockout organisms have been widely used in research,  improvement of quality of plants and medical treatment of diseases.

Page Expired
5off
It looks like your free minutes have expired! Lucky for you we have all the content you need, just sign up here