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by: Aj Oliver

Lecture 21 SCREENCAST MCB 150

Aj Oliver

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Cover Of The Weekends Lecture
Molecular and Cellular Biology
Bradley G Mehrtens
Study Guide
#MCB150 #MolecularAndCellularBiology
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Popular in Molecular and Cellular Biology

Popular in Biology

This 15 page Study Guide was uploaded by Aj Oliver on Saturday March 12, 2016. The Study Guide belongs to MCB 150 at University of Illinois at Urbana-Champaign taught by Bradley G Mehrtens in Summer 2015. Since its upload, it has received 80 views. For similar materials see Molecular and Cellular Biology in Biology at University of Illinois at Urbana-Champaign.


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Date Created: 03/12/16
MCB 150 Lecture 21 SCREENCAST Nuclear Structure and Domains I. Nuclear Structure a. The Nucleus: i. The regions of the nucleus labeled 1­8: 1. Nucleoplasm – The aqueous compartment inside the nuclear  envelope, that is essentially the nuclear counterpart to the  cytoplasm  2. Chromatin – Chromatin fibers – most of the interphase nucleus is  comprised of molecules that look like beads on a string 3. Nucleolus – the dense feature in the middle of the nucleus 4. Outer membrane of the nuclear envelope 5. Inner membrane of the nuclear envelope 6. Perinuclear space – space between the inner and outer  membranes of the nuclear envelope 7. Nuclear pore complexes – how larger molecules are transported  in and out of the nucleus 8. Nuclear lamina – provides a point of attachment for  heterochromatin and gives the nucleus its shape and structure b. Functional Domains of the Nucleus: i. In 1885, Carl Rabl proposed that each chromosome occupies a distinct  territory ii. In the figure, you see a representation of an interphase nucleus of a  hypothetical cell with the chromosomes inside colored in different colors 1. This is 2D representation for a spherical 3D figure 2. These chromosomes occupy its own territory and there’s little  overlap between each chromosome iii. In 1984, the Rabl model of chromosome organization was confirmed by  detailed studies of polytene chromosomes in Drosphila 1. In drosphila, there are some specialized cells in the salivary glands of these animals in which the chromosomes replicate, but don’t get separated – called polytene chromosomes a. Can have hundreds or thousands of identical DNA  molecules still linked together b. This allows one to see the interphase chromosomes under  light microscopy II. Visualizing Nuclear Domains a. Fluorescence (in situ hybridization) or FISH can visualize and identify  chromosomes i. Process is: 1. Isolate some cells, immobilize them on a glass slide, crack open  the cells, and get rid of all of the non­DNA parts. After, denature  the DNA that’s left a. This means that the DNA will not move from the slide, and also that the strands are next to each other, but they’re not  holding on to each other via complementary base pairs b. This denaturing is also important because if we sent in a  probe molecule that was complementary to a region on one  of those chromosomes, then the probe wouldn’t be  hybridized if the molecule was not denatured  2. In a separate part of the experiment, we create the probe molecule a. Will be fluorescent and detectable 3. Will be complementary to the target sequence once we denature  the probe 4. Add a solution of our free floating, single stranded probe molecule  to the immobilized denatured DNA on the slide and allow the  probe to seek out something that it can hybridize to a. If it doesn’t find anything, it will get washed off b. If it does find something that it’s complementary to, it will  form hydrogen base pairs to the gene 5. We activate our probe and look at our slides under a fluorescence  microscope  6. Can generate a picture to detect the fluorescence ii. In the next figure, 1. Picture  of FISH 2. Chromosomes started as mitotic chromosomes 3. General stain dye was red 4. Fluorescent molecule is bright yellow a. 4 bright spots on two chromosomes b. Chromosome Painting: i. Extends process of FISH ii. Every one of the probes is specific for a different region of a particular  chromosome iii. If you have enough of these probes, and they’re all specific for the same  chromosome, just different regions of it and they overlap somewhat, and  they’re all using the same fluorescent dye, then theoretically you could  make the entire length of that chromosome light up 1. This is shown in these fluorescent images 2. Each one of the fluorescence represents the maternal and paternal  copies of the chromosomes c. Chromosome painting can help us visualize chromosomal domains: i. Use the technique of chromosome painting to paint each unique  chromosome a different color d. Using these techniques, i. If Rabl’s hypothesis was incorrect, the chromosomes would overlap each  other 1. The colors would melt together to form a gray­brown color ii. If Rabl’s hypothesis was correct, then each chromosome occupies its own  territory 1. The colors would be unique iii. This figure proves the interphase chromosomes occupy their own territories iv. Also proves that the nucleus is divided into domains that play important  roles in how functions are carried out in the nucleus e. Chromosomal domains (or territories): i. Each chromosome occupies a distinct territory within the nucleus, and is  arranged in an organized fashion ii. Nuclei are divided into discrete functional domains that play an important  role in regulating gene expression and in replication iii. The space that is not part of the chromosomal territory is the inter­ chromosomal territory (or domain) III. Transcription and Processing a. Nuclear domains provide localized regions of function for the activities that occur in the nucleus: i. DNA replication 1. Is it together and organized or is it randomly dispersed throughout  the nucleus? a. To find the answer, we can use fluorescently labeled  dNTPs to study where DNA replication is occurring 2. The figure represents a section of chromosome where replication is about to begin a. Because this is a eukaryotic chromosome, we can expect to  have multiple oris, and each will be recognized and  unwound b. Once each replication bubble unwinds, we allow replication to begin using fluorescently labeled nucleotides shown in  red i. This allows us to see where DNA replication is  initiating c. Location of the fluorescence tells where DNA replication is occurring at that moment ii. Fluorescence detection of replication foci: 1. The figure shows a white dotted out line that’s supposed to  represent the nucleus a. If DNA replication was unorganized, you would see a light  red color diffuse throughout the nucleus i. This is because the various origins of replication  throughout the human genome are essentially firing  randomly, preventing one from seeing a localized  region of color b. If DNA replication is organized, we could be able to see  clusters of DNA replication i. Data support this hypothesis ii. If you do this experiment, you see spots 1. Each one of the spots is called a focus of  replication iii. Each red dot is NOT one origin of replication or one replication bubble iv. Each replication focus is 200­300 ori (replicons) 1. Replicon is the unit of DNA replicated from  a single origin of replication v. Probably ≥ 100 foci of replication in the human  nucleus vi. This means that it is easier to bring the DNA to the  machinery rather than scattering the machinery  throughout the DNA b. The eukaryotic cell cycle, revisited: i. The cell cycle is separated into interphase and M phase 1. Interphase is separated into G ,1S, and G 2 2. G  1tands for first gap phase a. Phase immediately after M phase b. In this phase, the cell is growing and building up its  nutrient base c. Checks for damage in its DNA d. Preparing to launch into the next extremely important thing that’s going to happen to the cell and that’s undertaking  DNA replication 3. S phase stands for the synthesis of DNA a. Other processes such as transcription do not shut down  during this phase just because DNA is being synthesized b. Lasts a long time i. Because of this, does DNA replication occur  immediately at the beginning of S phase, or is DNA replication spread throughout S phase? 4. After S phase ends, the second gap phase initiates, called G 2 a. Makes sure that you’ve fixed problems with the DNA b. Makes sure that you’re ready to go through the next round  of m­phase ii. DNA replication pattern: 1. Incorporate one fluorescent dye during early S­phase (DNA  Synthesis) and a different dye during late S­phase a. First dye is blue and second dye is red b. If first hypothesis is true, we would see all blue  fluorescence and no red fluorescence c. If second hypothesis was true, we would see both blue and  red fluorescence i. Data support this hypothesis ii. The fluorescence shows the foci of replication iii. Blue dots are scattered throughout the nucleus while the red dots appear around the periphery of the  nucleus and in pockets in the nucleus iv. This models the distribution between euchromatin  and heterochromatin 1. Gene density—how many genes are there in  a given unit length of DNA a. If we have two pieces of double  stranded DNA i. Molecule A has  100,000 bp  and 15 genes ii. Molecule B has 100,000 bp  and 1 gene iii. Molecule A has higher gene  density b. Higher the gene density, the more  likely it is to be called on the cell to  do transcription on one or more of  those genes c. The lower the gene density, the more likely the chromatin will be packed  as heterochromatin v. Euchromatin more likely to be unwound first  compared to heterochromatin because euchromatin  is already unpacked IV. Transcription and Processing a. Nuclear domains provide localized regions of function for the activities that occur in the nucleus: i. Transcription 1. Is it organized or randomly distributed? 2. We can test this using fluorescence 3. If we take an interphase nucleus and stain it with a fluorescent dye  that is specific for chromatin, then anywhere the dye finds  chromatin, it binds and that’s where you’ll see the color 4. In the nucleus, you can see that it has been stained for chromatin  and the brighter the white color, the more light it is, the more  chromatin there was 5. This shows the difference between the chromosomal territories and the interchromosomal domains a. Areas of brightest white have the most chromatin b. Areas of darker regions have the least chromatin in it c. The two areas that are circles in the middle are the  exceptions because they are the nucleoli i. Dye is unable to reach the chromatin in the  nucleolus 6. Inside the red rectangle lies an interchromosomal territory a. The dark area in the middle of the red rectangle is  interchromosomal territory b. There exists chromatin that is pushed inside the  interchromosomal territory i. The cell does this because it needs to work on that  region of DNA and in the interchromosomal  territories, you find the machinery to do  transcription and processing ii. This proves that it’s easier to put the DNA where  the machinery is and illustrates that the additional  processes are systematic and not random 7. In the next image, a different colored stain is used for splicing  factors a. This includes molecules within snRNPs b. This image shows that the snRNPs are located within  clusters in the nucleus  b. The interchromosomal domain is highly organized: i. Green is in the chromosomal territories ii. Red is in the interchromosomal domains iii. If there is a region of DNA you need to be working on, you will simply  loop it out to an interchromosomal territory because that’s where the  machinery is c. A reminder about microscopic techniques: i. Fluorescence microscopy: “brighter” = “more” ii. Electron microscopy: “darker” = “more” d. With “periphery” i. Could refer to the edges of the nucleus near the nuclear lamina ii. Could also refer to the edges between the chromosomal domain and the  interchromosomal domain V. Summary of Nuclear Domains a. This image shows some artificial colors superimposed over a fluorescent image  staining of chromatin i. The region labeled A, the yellow chromosome, reminds you that every  chromosome occupies its own territory 1. Inside the white rectangle, a region of euchromatin is shown that  has been unwound, pushed into an interchromosomal territory, in  order to transcribe genes that need to be active at that moment 2. The red shaded regions of the yellow loop represent  transcriptionally active genes and the loop is a region of  euchromatin that has been pushed out into the interchromosomal  territory a. The interchromosomal territory is where RNA polymerase  II, type II transcription factors, and where the capping  enzymes and Poly­A polymerase and splicing machinery  are located ii. The region labeled B shows that not only does a chromosome occupy its  own territory and it doesn’t interfere with another chromosome’s territory, but even the arms of a given chromosome don’t generally overlap 1. This region in green one arm of a chromosome 2. In red, the other arm of that chromosome 3. Centromere region is shaded in gold iii. In the region labeled C, there is heterochromatin vs euchromatin 1. The brighter the yellow, the more likely it is to be euchromatin 2. The darker the red, the more likely it is to be heterochromatin 3. The euchromatin is located on the periphery of the chromosomal  territory because it is about to be used 4. The heterochromatin is moved out of the way by moving it to the  periphery of the nucleus or buried in the interior of the  chromosomal territory iv. The region labeled D shows replication patterns 1. The areas shaded in green show regions of DNA that are going to  be replicated early during S phase because they are already  unwound 2. The areas shaded in red are going to be replicated late during S  phase because they exist as heterochromatin 3. The gold line represents scaffolding proteins that hold chromatin  together in a packed state v. The region labeled E is showing the difference between transcriptionally  active and transcriptionally silent genes 1. Within the white rectangle, the white circles are transcriptionally  active genes 2. Black circles are transcriptionally silent genes 3. Transcriptionally active genes are located in the periphery of the  territory because that’s where the transcription and processing  machinery is located 4. The gold circles represent nuclear speckles a. These are clusters of transcription and processing  machinery, and they are recruited to areas of active  transcription vi. The region shaded in green and labeled F is an interchromosomal territory 1. Whenever the chromosome doesn’t occupy space, that’s  considered an interchromosomal territory 2. Because the chromatin is long and flexible, the interchromosomal  territories look like a web rather than a big block of space 3. Inside the white box, you see larger clusters of processing and  transcription machinery and smaller speckles 4. Collect very large aggregations of processing and splicing factors  and smaller speckles are sent out vii. The region labeled N is the nucleolus VI. Lecture—Nuclear Lamina a. The nuclear lamina is made up of lamin proteins i. 3 types: A, B, and C ii. Lamin A and Lamin C are alternatively spliced from LMNA gene 1. Supposed to be soluble (not bound to a membrane) iii. In Lamin A (but not C), a lipid entity called a farnesyl group gets attached  to the protein 1. Lamin A is initially attached to the nuclear envelope 2. The farnesyl group is then removed, and the resulting protein is  free to be an unbound component of the lamina iv. A single point mutation in a 57,000 bp­long gene leads to an inability to  become de­farnesylated 1. This mutation activates a cryptic splice sites 2. This resulting mis­processed protein is called Progerin b. Chromatin organization is critical for cell division i. Progerin stays attached to the envelope, weakening the lamina and the  entire nuclear envelope ii. Weakening of the lamina limits the cell’s ability to divide c. A connection with telomeres i. Progerin is found in normal cells in low amounts ii. As cells age, shortened telomere length activates increased Progerin  levels, further aging the cells d. Hope for the future? i. Farnesyltransferase inhibitors (FTIs) are in animal testing, and are  showing promising leads


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